Online Casino Sg

🔥 Selamat datang di Online Casino Sg — Jelajahi tren terbaru tentang slot-apk-bet-40!

Evaluasi Komparatif Kit Enzyme-Linked Immunoassay WHO dan DAKOPATTS untuk Deteksi Rotavirus

Feses dari 1163 anak (termasuk 66 bayi baru lahir) dianalisis secara paralel untuk keberadaan partikel rotavirus menggunakan dua kit enzyme-linked immunosorbent assay. Kit tersebut telah diformulasikan oleh WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Rotavirus (kit WHO-ELISA) dan oleh DAKOPATTS (kit DAKO-ELISA) agar sesuai digunakan di laboratorium di negara berkembang. Kit dievaluasi di laboratorium di Burma, Chili, India, Meksiko, Pakistan, Sri Lanka, dan Inggris. Perbandingan hasil yang diperoleh dengan kedua kit menunjukkan bahwa DAKO-ELISA memiliki sensitivitas keseluruhan 97% dan spesifisitas 97% relatif terhadap WHO-ELISA. Di laboratorium individu, DAKO-ELISA (K349) memiliki sensitivitas dalam kisaran 90-100%, dan spesifisitas 85-100%. Kit menunjukkan sensitivitas 100% dan spesifisitas 98% pada pengujian feses dari bayi baru lahir. Kami menyimpulkan bahwa DAKO-ELISA sama sensitif dan spesifiknya dengan WHO-ELISA untuk deteksi antigen rotavirus dalam feses.

Pendahuluan

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) telah mapan sebagai teknik yang sensitif dan spesifik untuk deteksi antigen rotavirus dalam tinja. Teknik ini diadopsi oleh WHO sebagai teknik diagnostik standar untuk digunakan dalam studi epidemiologi di negara berkembang. Di bawah naungan Program Pengendalian Penyakit Diare WHO (CDD), WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Rotaviruses di East Birmingham Hospital, Inggris, mengembangkan kit ELISA untuk didistribusikan ke laboratorium yang melakukan studi yang didanai oleh WHO (1). Uji ini terbukti sangat sensitif, spesifik, dan sederhana untuk dilakukan. Kit ini mengandung bahan-bahan terliofilisasi untuk menjamin stabilitas reagen selama penundaan dan suhu lingkungan tinggi yang mungkin ditemui selama transportasi ke laboratorium di negara berkembang. Banyak kit komersial berbasis ELISA sekarang tersedia untuk dibeli dan banyak digunakan dalam diagnosis infeksi rotavirus pada anak-anak di negara maju. Kit DAKOPATTS Rotavirus ELISA awalnya diformulasikan untuk digunakan di negara maju dan terbukti sensitif dan spesifik serta memberikan pembacaan visual yang mengidentifikasi sekitar 98% spesimen positif (2, 3). Kit ini telah dimodifikasi, atas permintaan WHO, sehingga cocok untuk didistribusikan ke laboratorium di negara berkembang. Enam laboratorium diagnostik yang melakukan studi epidemiologi infeksi rotavirus pada anak kecil di Burma, Chili, India, Meksiko, Pakistan, dan Sri Lanka dipilih untuk evaluasi komparatif hasil yang diperoleh menggunakan WHO dan kit DAKOPATTS (K349) yang dimodifikasi. Selain itu, kedua kit dievaluasi di WHO Collaborating Centre di Birmingham, Inggris.

Bahan dan Metode

Spesimen

Sampel tinja dikumpulkan dari anak kecil yang datang ke rumah sakit atau klinik dalam waktu 72 jam setelah onset diare akut. Jumlah spesimen yang diperoleh oleh setiap laboratorium tercantum dalam Tabel 1; laboratorium di negara berkembang diidentifikasi dengan kode huruf (A hingga F) yang tidak sesuai dengan urutan abjad yang digunakan dalam teks ini. Sampel yang dikumpulkan oleh laboratorium F termasuk 66 tinja yang diperoleh dari bayi baru lahir dengan dan tanpa diare. Spesimen disimpan pada suhu 4 °C, atau -20 °C atau -70 °C sebelum pengujian. Spesimen yang dikumpulkan di setiap laboratorium diuji secara duplikat selama beberapa hari menggunakan WHO-ELISA dan DAKO-ELIDA sesuai dengan instruksi yang disertakan dengan masing-masing kit.

Uji ELISA

WHO-ELISA merupakan ELISA sandwich ganda tidak langsung, dilakukan dalam dua tahap (1). Pertama, uji skrining dilakukan secara duplikat pada sumuran yang dilapisi dengan serum kelinci pasca-imun. Spesimen yang memberikan hasil positif dalam uji skrining selanjutnya diuji dengan uji blokade konfirmasi ELISA menggunakan empat sumuran yang dilapisi dengan serum kelinci pasca-imun. Spesimen diuji setelah dicampur dengan serum pra-imun negatif antibodi rotavirus, atau dengan serum rotavirus hiperimun. Uji WHO-ELISA dilakukan dengan melapisi pelat mikrotitrasi polistiren dengan antisera antirotavirus (kelinci) hiperimun. Sumuran direaksikan dengan ekstrak tinja jernih 10% (v/v) dalam saline fosfat (pH 7,4) yang mengandung 0,1% polioxietilena sorbitan monolaurat (Tween 20) dan 0,01 mol/l garam dinatrium EDTA. Antigen rotavirus dideteksi menggunakan serum anti-rotavirus kelinci percobaan hiperimun, diikuti oleh IgG anti-kelinci percobaan yang dimurnikan afinitas terkonjugasi dengan alkaline fosfatase (Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, MD, USA) yang direaksikan dengan p-nitrofenil fosfat dinatrium. Kepadatan optik reaksi warna dibaca dengan spektrofotometer yang diatur pada 405 nm. Tidak ada sampel yang dilaporkan positif sampai diuji duplikat dalam uji blokade konfirmasi. Uji blokade dianggap positif jika rata-rata pembacaan OD pada dua sumuran yang mengandung serum pasca-imun lebih dari 50% dari sumuran yang mengandung serum kambing pra-imun. Antigen kontrol positif dan negatif disertakan dalam kit. Uji ini memakan waktu 2 hari untuk skrining dan tambahan 2 hari untuk konfirmasi.

DAKO-ELISA dilakukan dengan melapisi pelat mikrotitrasi polistiren dengan baris duplikat fraksi imunoglobulin dari antisera antirotavirus kelinci hiperimun dan serum kelinci kontrol negatif, diikuti oleh penambahan ekstrak tinja. Ekstrak tinja awalnya disiapkan sebagai suspensi 10% (v/v) dalam 0,15 mol/l natrium klorida, dijernihkan dengan sentrifugasi kecepatan rendah. Ekstrak tinja yang digunakan dalam uji terdiri dari pengenceran 1:10 supernatan dalam buffer pengencer PBS (pH 7,4) dengan tambahan 0,1% Tween 20 dan 1% albumin serum sapi. Setelah adsorpsi dan pencucian, reaksi non-spesifik diblokir dengan menambahkan imunoglobulin kelinci normal, diikuti oleh antiserum antirotavirus kelinci hiperimun yang terkonjugasi dengan peroksidase. Antigen rotavirus dideteksi dengan reaksi dengan o-fenilena diamina dalam asam sitrat dan buffer fosfat dengan adanya hidrogen peroksida. Antigen kontrol positif disertakan dalam kit. Uji dapat dilakukan dalam waktu kurang dari 5 jam. Hasil dapat dibaca secara visual dengan membandingkan warna sumuran uji dengan warna sumuran kontrol negatif yang sesuai. Absorbansi cairan dalam sumuran dapat diukur pada 492 nm menggunakan spektrofotometer. Kriteria uji positif adalah absorbansi sumuran uji dikurangi absorbansi sumuran kontrol negatif lebih besar dari 0,1, dan absorbansi sumuran uji dibagi absorbansi sumuran kontrol negatif lebih besar dari 6. Jika perbedaan antara nilai absorbansi sumuran uji duplikat melebihi 20 persen, maka uji harus diulang.

Kit WHO-ELISA menyediakan semua bahan yang diperlukan, termasuk buffer. Serum kelinci pra-imun dan hiperimun anti-rotavirus, serum anti-rotavirus kelinci percobaan, konjugat alkaline fosfatase, antigen kontrol rotavirus positif dan negatif disediakan beku-kering. Kit DAKO-ELISA yang dimodifikasi untuk digunakan di negara berkembang mencakup konjugat peroksidase terliofilisasi bersama dengan pelarut untuk rekonstitusi. Antigen kontrol positif terliofilisasi disediakan dalam kemasan vakum, dan fenilena diamina disediakan dalam bentuk tablet dalam vial berisi desikan. Kit WHO-ELISA dan DAKOPATTS-ELISA dikirim ke setiap laboratorium melalui kargo udara tanpa pengaturan khusus untuk transportasi cepat, untuk mensimulasikan kondisi biasa pasokan bahan ke laboratorium ini.

Konfirmasi Hasil ELISA

Mikroskopi elektron ekstrak tinja yang diwarnai negatif digunakan untuk mengkonfirmasi hasil ELISA positif dan negatif oleh laboratorium C dan D. Elektroforesis gel RNA genom rotavirus (4) digunakan untuk mengkonfirmasi hasil ELISA positif dan negatif oleh laboratorium A, B, dan D. Laboratorium E mengembangkan uji blokade menggunakan reagen DAKO dan serum manusia pra-imun dan pasca-imun untuk mengevaluasi hasil positif lemah yang diperoleh dengan uji DAKOPATTS. Campuran spesimen positif lemah dengan serum manusia non-imun atau hiperimun ditambahkan ke empat sumuran yang dilapisi dengan antisera antirotavirus kelinci hiperimun DAKO. Uji blokade analog dengan yang digunakan dalam uji WHO.

Hasil

Perbandingan hasil yang diperoleh dengan kedua kit tercantum dalam Tabel 1. Semua hasil dari total 1163 spesimen awalnya dibaca dengan mata. Selain itu, hasil dari 953 spesimen dibaca dengan pengukuran kepadatan optik (OD) menggunakan spektrofotometer. Hasil yang berbeda untuk spesimen yang sama menggunakan kit WHO dan DAKO terjadi di semua laboratorium. Jumlah hasil yang berbeda berkisar dari 1 (0,5%) (laboratorium E) hingga 21 (10%) (laboratorium C). Untuk memperkirakan sensitivitas dan spesifisitas hasil yang diperoleh dengan kit DAKOPATTS, hasil yang diperoleh dengan kit WHO dianggap sebagai standar referensi. Tabel 1 menunjukkan bahwa hasil negatif palsu diperoleh dengan kit DAKOPATTS (WHO+ dan DAKO-) untuk 10 dari 307 spesimen positif WHO, menunjukkan sensitivitas keseluruhan untuk kit DAKOPATTS sebesar 96,7%. Satu spesimen dari laboratorium A terbukti positif ketika uji DAKOPATTS diulang. Dua spesimen dari laboratorium D terbukti mengandung partikel rotavirus ketika diperiksa dengan mikroskopi elektron. Keberadaan partikel rotavirus pada 11 spesimen lainnya yang WHO+ dan DAKO- tidak dapat dikonfirmasi menggunakan mikroskopi elektron. Sebagian besar spesimen ini memberikan hasil positif lemah, menghasilkan sedikit warna ketika dibaca dengan mata. Di laboratorium individu, sensitivitas kit DAKOPATTS dihitung sebagai 100% (A, E, F), 98,5% (B), 92% (C), dan 90,4% (D). Tabel 1 menunjukkan bahwa sensitivitas kit DAKOPATTS yang dicatat oleh WHO Collaborating Centre di Inggris adalah 100%.

Dua puluh enam (3%) dari total 845 spesimen negatif WHO memberikan hasil WHO- dan DAKO+ (Tabel 1). Keberadaan partikel rotavirus tidak dapat dikonfirmasi pada salah satu spesimen positif palsu yang tampak dari laboratorium A, B, D, dan E menggunakan mikroskopi elektron atau elektroforesis RNA. Satu spesimen yang diperiksa oleh laboratorium B mungkin sebenarnya mengandung partikel rotavirus karena pasien telah mengeluarkan rotavirus tiga hari sebelumnya. Perbedaan terbesar dalam hasil antara kedua kit diamati di laboratorium C, dan tidak dapat dijelaskan secara pasti. Namun pada saat itu, laboratorium ini relatif tidak berpengalaman dalam melakukan ELISA dan hasil yang berbeda kemungkinan disebabkan oleh reaksi positif palsu yang terjadi dengan kedua kit. Spesifisitas keseluruhan kit DAKOPATTS, dengan mengambil hasil WHO sebagai standar referensi adalah 96,9%, dengan spesifisitas individu tercatat 100% (A), 99,5% (E), 99,1% (D), 98,9% (B), 98,7% (F), dan 85% (C).

Sebagian besar hasil positif palsu dan negatif palsu dengan kit DAKOPATTS melibatkan spesimen yang memberikan reaksi lemah. Tabel 2 mencantumkan pembacaan kepadatan optik untuk 20 spesimen positif rotavirus yang diperiksa secara paralel oleh kit WHO dan DAKOPATTS di WHO Collaborating Centre di Inggris. Hasil diklasifikasikan sebagai pembacaan positif kuat, sedang, atau lemah. Pembacaan OD rendah yang diamati dengan beberapa spesimen menggunakan kit WHO setelah uji skrining menekankan perlunya melanjutkan ke uji blokade konfirmasi menggunakan kit ini. Dengan kit DAKOPATTS ada perbedaan yang jelas antara reaksi dengan serum positif dan dengan serum negatif bahkan ketika pembacaan OD keduanya rendah. Kesulitan dalam membedakan perbedaan ini dengan mata dapat menjelaskan hasil positif palsu yang diperoleh di beberapa laboratorium.

Tabel 1. Perbandingan hasil diagnosis rotavirus menggunakan kit enzyme-linked immunoassay yang disediakan oleh WHO dan DAKOPATTS (DAKO) Laboratorium Jumlah diuji WHO+ DAKO+ WHO+ DAKO- WHO- DAKO- WHO- DAKO+ WHO Collaborating Centre di Inggris 133 20 112 0 1 A 92 33 58 1 0 B 159 64 93 1 1 C 219 70 122 6 21 D 238 19 215 2 2 E 210 67 142 0 1 F (66)* 112 34 (24) 77 (41) 0 (0) 1 (1) Catatan: DAKO positif saat diulang. b Positif dengan mikroskopi elektron. c Dikonfirmasi positif dengan blokade. d Angka dalam kurung merujuk pada spesimen dari bayi baru lahir.
Tabel 2. Perbandingan pembacaan kepadatan optik untuk 20 spesimen positif rotavirus menggunakan kit enzyme-linked immunoassay yang disediakan oleh WHO dan DAKOPATTS Tingkat positif WHO (uji skrining) DAKOPATTS dengan serum positif DAKOPATTS dengan serum negatif Kuat 1,295-1,308 2,000-1,766 0,078-0,028 Sedang 0,640-0,691 1,358-2,000 0,001-0,004 Lemah 0,097-0,283 0,185-0,867 0,002-0,012 Semua hasil kepadatan optik adalah rata-rata dari pembacaan duplikat.

Diskusi

Uji ELISA yang diadopsi oleh WHO sebagai teknik standar untuk diagnosis infeksi rotavirus telah banyak digunakan di laboratorium negara berkembang. Format kit secara hati-hati disesuaikan dengan masalah yang mungkin dihadapi selama penggunaannya di negara-negara ini. Kit ini mengandung bahan-bahan terliofilisasi untuk menghindari kerusakan selama transportasi, dan termasuk pelarut yang sesuai untuk menghindari kontaminasi bahan kimia sensitif dengan kotoran yang sering ada dalam air di negara berkembang. Kinerja kit ini dipantau secara ekstensif terhadap mikroskopi elektron dan sensitivitas serta spesifisitasnya ditetapkan (1).

Perbandingan hasil ini ketika spesimen tinja diuji secara paralel menggunakan kit WHO dan DAKOPATTS di tujuh laboratorium berbeda (Burma, Chili, India, Meksiko, Pakistan, Sri Lanka, dan Inggris) menunjukkan kesesuaian yang baik antara kedua kit. Kit DAKOPATTS memiliki sensitivitas keseluruhan 96,7% dan spesifisitas keseluruhan 96,9%, menggunakan hasil kit WHO sebagai standar referensi. Korelasi yang baik ini antara kedua kit diperoleh baik di laboratorium asal kit WHO (Inggris) maupun setelah transportasi ke laboratorium yang jauh. Kit DAKOPATTS menunjukkan reaksi yang sangat spesifik ketika spesimen tinja dari bayi baru lahir diperiksa. Ini berbeda dengan pengalaman dengan kit lain di mana reaksi positif palsu lebih umum dengan pengujian tinja yang diperoleh pada periode neonatal (5).

Secara keseluruhan, ada kesesuaian yang sangat baik antara hasil yang diperoleh dengan kedua tes di enam dari tujuh laboratorium. Perbedaan hasil diamati di satu laboratorium yang awalnya mengalami kesulitan dengan kedua tes karena kurang pengalaman. Ini menekankan fakta bahwa keahlian merupakan keuntungan dalam melakukan dan membaca uji ELISA, dan staf laboratorium memerlukan pelatihan awal saat memulai uji ini. DAKO-ELISA sederhana untuk dilakukan, dan hasil diperoleh lebih cepat dibandingkan dengan WHO-ELISA. Pembacaan visual memuaskan dalam sebagian besar kasus, tetapi reaksi positif lemah (setara dengan OD 0,50) perlu diulang. Sumuran duplikat kadang-kadang menunjukkan perbedaan. Pabrikan merekomendasikan uji diulang jika sumuran duplikat berbeda lebih dari 20%. Secara umum, pembacaan dengan mata pada kedua uji sesuai dengan nilai OD pada spektrofotometer. Yang terakhir ini berguna dalam membedakan nilai positif dan negatif ketika reaksi awalnya "positif lemah". Modifikasi yang dimasukkan dalam kit DAKOPATTS (K349) tampaknya mengatasi masalah yang kadang-kadang dihadapi dengan kit yang digunakan di laboratorium negara berkembang. Kit yang dimodifikasi mengandung konjugat peroksidase terliofilisasi, dan antigen kontrol positif dan negatif. Stabilitas enzim-substrat dijamin dengan menyediakan tablet 1,2-fenilena diamina, dikemas dengan desikan, dan terbukti stabil setidaknya selama 3 tahun pada suhu 4-8°C (informasi pabrikan). Kit juga menyediakan vial air suling yang mengandung 15 mmol/l natrium azida untuk memungkinkan konjugat peroksidase direkonstitusi tanpa risiko pengotoran dari pasokan air setempat mengganggu aktivitasnya.

Hasil studi komparatif ini menunjukkan bahwa kit DAKOPATTS yang dimodifikasi (K349) memiliki sensitivitas dan spesifisitas tinggi relatif terhadap kit WHO-ELISA. Formatnya membuatnya sangat cocok untuk diagnosis rotavirus dalam studi etiologi yang dilakukan oleh laboratorium di negara berkembang.

Keamanan dimulai dengan memahami cara developer mengumpulkan dan membagikan data Anda. Praktik privasi dan keamanan data dapat bervariasi berdasarkan penggunaan, wilayah, dan usia Anda.

T: Bagaimana cara mengunduh Online Casino Sg?
J: Cukup klik tombol instal berwarna hijau di bagian atas dan ikuti instruksi amannya.

T: Apakah Online Casino Sg mematuhi GDPR?
J: Ya, Online Casino Sg sepenuhnya mematuhi regulasi privasi data internasional termasuk GDPR.